CRISPR-Cas9系統是存在于細菌中的一種天然的免疫系統,每當有病毒入侵時,即可對外源基因組進行編輯,起到保護細菌細胞的免疫功能。基于CRISPR-Cas9強大的基因組編輯能力,科研人員將細菌天然的免疫系統改造成一種可在實驗室中廣泛使用的基因編輯工具,也是繼ZFN和TALEN之后的第三代基因編輯工具。

CRISPR-Platform

CRISPR-Cas9的廣泛應用

  1. 基因敲除(Knock-out)
  2. Cas9可以對靶基因組進行剪切,形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下,細胞會采用高效的非同源末端連接方式(NHEJ)對斷裂的DNA進行修復。但是,在修復過程中通常會發生堿基插入或缺失的錯配現象,造成移碼突變,使靶標基因失去功能,從而實現基因敲除。為了提高CRISPR系統的特異性,可將Cas9的一個結構域進行突變,形成只能對DNA單鏈進行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設計兩條sgRNA序列,分別靶向DNA互補的兩條鏈,這樣兩條sgRNA特異性的結合靶標序列,即可形成DNA斷裂,并在修復過程中通過移碼突變實現基因敲除

  3. 基因敲入(Knock-in)
  4. 當DNA雙鏈斷裂后,如果有DNA修復模板進入到細胞中,基因組斷裂部分會依據修復模板進行同源重組修復(HDR),從而實現基因敲入。修復模板由需要導入的目標基因和靶序列上下游的同源性序列(同源臂)組成,同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈,也可以是雙鏈DNA質粒。HDR修復模式在細胞中發生率較低,通常小于10%。為了增加基因敲入的成功率,目前有很多科學家致力于提高HDR效率,將編輯的細胞同步至HDR最活躍的細胞分裂時期,促進修復方式以HDR進行;或者利用化學方法抑制基因進行NHEJ,提高HDR的效率

  5. 基因抑制、基因激活(Repression or Activation)
  6. Cas9的特點是能夠自主結合和切割目的基因,通過點突變的方式使Cas9的兩個結構域RuvC-和HNH-失去活性,形成的dCas9只能在sgRNA的介導下結合靶基因,而不具備剪切DNA的功能。因此,將dCas9結合到基因的轉錄起始位點,可以阻斷轉錄的開始,從而抑制基因表達;將dCas9結合到基因的啟動子區域也可以結合轉錄抑制/活化物,使下游靶基因轉錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于,dCas9造成的激活或者抑制是可逆的,并不會對基因組DNA造成永久性的改變。

  7. 多重編輯(Multiplex Editing)
  8. 將多個sgRNA質粒轉入到細胞中,可同時對多個基因進行編輯,具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應用包括:使用雙Cas9nickases提高基因敲除的準確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下,一個質粒上可以構建2~7個不同的sgRNA進行多重CRISPR基因編輯。

  9. 功能基因組篩選
  10. 利用CRISPR-Cas9進行基因編輯可以產生大量的基因突變細胞,因此利用這些突變細胞可以確認表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導致的。基因組篩選的傳統方法是shRNA技術,但是shRNA有其局限性:具有很高的脫靶效應以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結果。CRISRP-Cas9系統的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優勢,在基因組篩選中得到了廣泛的應用。目前CRISPR的基因組篩選功能應用于篩選對表型有調節作用的相關基因,如對化療藥物或者毒素產生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構建病毒篩選文庫對潛在基因進行大范圍篩選等。

 

哺乳動物基因編輯 新藥研發靶點篩選 基因治療
   
植物基因組編輯 微生物基因組編輯 crispri/a及其應用

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