使用CRISPR-Cas9系統對細菌基因進行可編程性的抑制和激活

【背景】

CRIPSR-Cas9系統是一種有效、便捷的基因組編輯技術,通過sgRNA介導突變后不具有切割活性的Cas9核酸酶(dCas9),結合特定的DNA序列位點,可以抑制或激活細菌的基因表達。目前,許多研究中需要精確地調節基因表達,而不僅僅是讓基因功能完全喪失,也可以促進或者抑制基因表達,因此dCas9技術激活或抑制基因表達的研究也受到了極大的關注,科研人員認為人為控制基因的轉錄對于基因功能的研究和基因網絡的構建具有重要意義。

【方法】

  1. 構建dCas9質粒系統(圖1),對Cas9基因10位點和840位點進行突變,使其失去對DNA雙鏈的切割活性。dCas9蛋白結合到靶基因的轉錄起始位點,阻止RNA聚合酶的結合,從而達到抑制轉錄起始和轉錄延伸的作用;
  2.  構建dCas9質粒抑制基因表達

  3. 構建了一系列與目標序列不匹配的crRNA(圖2),通過對crRNA 5’末端進行突變,形成 8個不同堿基突變的crRNA,將其轉入到細胞中檢測對基因表達造成的影響;
  4. 設計與目標序列具有不匹配堿基的crRNA

  5. 將ω亞基和dCas9的C-和N-終端融合鏈接起來,可以在啟動子的上游穩定的結合RNA聚合酶從而促進激活轉錄(圖3),并根據啟動子序列的不同位置設計了4個不同的crRNA,用來控制lacZ基因的表達(圖4);
  6. 針對啟動子上游區域不同位點設計4個crRNA(Z1-Z4)

  7. 在-35啟動子區域不同位置設計了10個crRNA,通過控制gfp-mut2基因的啟動子調節基因表達(圖5)。
  8. 在gfp-mut2基因的啟動子上游區域不同位點設計10個crRNA(W101-W110)

【結論】

  1. 為了評估和檢測dCas9對啟動子表達和轉錄延伸的抑制效果,構建GFP報告載體。結果顯示,在啟動子的-35和-10區域,dCas9減少了超過100倍的熒光,由此說明,dCas9靶定啟動子區后,能夠抑制啟動子表達,編碼區域和非編碼區域都觀察到了熒光的減弱,說明dCas9結合基因組后能夠阻止RNA聚合酶的結合(圖6);
  2. dCas9對啟動子表達的抑制效果和對轉錄延伸的抑制效果

  3. 不完全匹配的crRNA也可以調節dCas9的抑制表達水平,3’末端12個互補的dCas9序列(即8個不匹配序列)轉錄抑制的效果最強(圖7);
  4. 不同匹配程度的crRNA也可以調節dCas9的抑制表達水平

  5. 同時檢測了不同crRNA介導Cas9對DNA切割的能力,結果顯示對于不同的crRNA來說,不同匹配度的crRNA對DNA切割造成的影響也是不同的(圖8);
  6. 不同的crRNA介導Cas9對DNA切割的能力

  7. crRNA結合的位點與lac基因表達具有一定的相關性(圖9),Z4位置的crRNA的激活效果最好,具有2.8倍的激活率。但是,并不是所有的位點都可以促進基因表達,如果過于接近啟動子位點,則可能會抑制基因表達;
  8. 不同的crRNA與lac基因表達的相關性

  9. 10個不同crRNA中,W103和W108 crRNA能夠強效激活gfp-mut2基因表達(圖10);
  10. 啟動子上游區域不同位置的crRNA熒光表達量水平

  11. 使用W103和W108對gfp-mut2基因的三個變體進行激活測試可以得知,不同的啟動子介導dCas9可以使基因過表達,表達量與啟動子的類型具有一定的相關性(圖11)。
  12. W103和W108 crRNA對gfp-mut2基因的三個變體進行激活情況

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參考文獻
Bikard, D., et al., Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res,2013. 41(15): p. 7429-37.