利用CRISPRi技術調控基因表達

【背景】

CRISPRi技術是在CRISPR-Cas9基礎上,將Cas9蛋白改造成為不具有切割活性的dCas9,在sgRNA的介導下仍可以靶向基因組序列。CRISPRi技術能夠有效的抑制編碼基因和非編碼基因的表達,并可同時對多個基因進行調控且無脫靶率。CRISPRi技術的出現為研究基因的功能提供了高效的新方法。

【方法】

設計dCas9結構包括兩個突變體RuvC1-和HNH-。sgRNA包含三個部分:20nt用于與匹配目標序列,42nt用于與Cas9結合,40nt為轉錄終止結構。針對mRFP基因編碼序列不同區域設計sgRNA,用于檢測dCas9能否高效抑制基因表達。

dCas9與sgRNA設計方案

【結論】

  1. CRISPRi技術能夠抑制轉錄起始和延伸,靶向非模板鏈DNA的dCas9-sgRNA會產生有效的沉默;靶向模板鏈DNA的dCas9-sgRNA效果不明顯,dCas9-sgRNA結構靶向啟動子區域能夠造成有效的基因沉默(圖1);
  2. CRISPRi抑制轉錄延伸過程

  3. CRISPRi基因抑制過程是可逆的。 dCas9-NT1受 aTc啟動子控制,隨著時間的延長,mRFP蛋白熒光量先降后升,最后會恢復到與陽性對照相同的水平(圖2),由此說明CRISPRi基因敲除是一個可逆的過程;
  4. CRISPRi基因抑制表達過程

  5. 在目標位點上游轉錄暫停,暫停位點與目標位點之間長度為19bp堿基,由此得知CRISPRi通過抑制轉錄過程對基因表達進行調節(圖3);
  6. CRIPSRi作用于轉錄延伸過程

  7. CRISPRi sgRNA沉默是高特異性的,對全基因組范圍內的mRNA序列測序得知,sgRNA(NT1)靶向mRFP基因后,mRFP基因是唯一轉錄豐度降低的基因,沒有其他基因顯示出明顯的基因表達量的變化(圖4);
  8. CRISPRi sgRNA的沉默是高特異性

  9. CRISPRi能夠同時調節多個基因,設計兩個sgRNA分別靶向mRFP基因和sfGFP基因,CRISPRi系統可將兩個基因同時敲除,由此說明CRISPRi系統可以同時對多基因進行調節(圖5);
  10. CRISPRi同時對多個基因調節

  11. 決定CRISPRi沉默效率的因素:sgRNA長度、與目標序列的重合度以及sgRNA的位置CRISPRi抑制的效果與目標位點與起始位點之間的距離呈反比例相關(圖6),一般情況下,sgRNA與基因組序列有20bp重復序列用于靶向目標序列,而通過實驗數據可以得知基因沉默所需匹配序列的最短長度是12bp(圖7);sgRNA的最初7nt堿基區域對于基因沉默具有重要作用(圖8);使用兩個sgRNA靶向同一個基因,可以提高CRISPRi的效率,但是,如果兩個sgRNA具有重疊效應時,可能會降低CRISPRi的效率(圖9);
  12. sgRNA與目標基因組的匹配程度
    單sgRNA與雙重sgRNA靶向目標基因的效果

  13. CRISPRi技術可應用于內源性的基因網絡。針對大腸桿菌乳糖表達途徑上的相關基因設計sgRNA,結果可以得知,LacZ基因的表達量受到抑制,而LacI基因則被激活,表達量有所增加(圖10)。由此說明CRISPRi技術可以提供一個快速、有效的方法來驗證基因網絡中各個基因的功能;
  14. 大腸桿菌乳糖管理途徑上的相關基因表達量

  15. CRISPRi技術在人類細胞中也同樣適用,可對人類HEK293細胞系中的基因表達造成抑制(圖11)。
  16. CRISPRi使人類HEK293細胞內熒光表達量降低

CRISPR-Cas9服務訂購

  1. Email:請將您的詳細需求發送到[email protected]
  2. 電話訂購:您可以直接撥打免費熱線4000-973-630轉803聯系我們經驗豐富的工程師
  3. QQ咨詢:任何技術問題均可與我們在線互動,泓迅科技官方企業QQ:4000-973-630
  4. 關注泓迅科技微信公眾號:szhxswkj;按照“姓名+學校/公司名稱+聯系方式”給我們留言,即可免費獲取“CRISPR-Cas9基因編輯技術應用手冊”。

參考文獻
Qi, L.S., et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013. 152(5): p. 1173-83.