lentiCRISPR系統載體改良及GeCKO文庫用于功能基因組文庫篩選

【背景】

在人類和小鼠細胞中CRISPR-Cas9全基因組文庫已經替代了RNAi技術,成為一種新的篩選方式,并且這種技術在多種生物模型中被用于揭示新的機制。但是最初的由病毒包裝的CRISPR全基因組敲除(GeCKO)文庫病毒效價較低或者需要細胞系表達Cas9,限制了生物系統適合篩選的范圍。因此,改良CRISPR載體系統及GeCKO文庫對于生物全基因組功能篩選的應用具有重要的意義。本文提供了改良載體和GeCKO文庫的多種方法,并進行的嚴密的驗證,得到了改良的雙質粒系統以及高覆蓋率和高靈活度的GeCKO文庫。

【方法】

  1. 構建了新的lentiCRISPRV2系統:去除了傳統的lentiCRISPRV1NLS序列,對剩余的NLS序列和P2A順反子序列進行密碼子優化并對U6啟動子位置進行調整;
  2. 構建了雙載體系統,分別表達Cas9和sgRNA的lentiCas9-Blast和lentiGuide-Puro(圖1);
  3. 單質粒載體系統和雙質粒載體系統的構建

  4. 改良GeCKO文庫:在特異性分析的基礎上提高脫靶分數從而降低脫靶效率,突變pre-miRNA的發卡結構來抑制miRNA在轉錄過程中的作用,增加了1,000個基因的sgRNA;
  5. 改良GeCKO文庫分成兩個亞文庫,每個亞文庫包括3個sgRNA和1,000個對照sgRNA。

【結論】

  1. 單載體的lentiCRISPRV2系統比lentiCRISPRV1的病毒滴度高10倍;雙載體的lentiGuide-Puro系統比lentiCRISPRV1高100倍(圖2);
  2. 結合的亞文庫對全基因組進行篩選可以提高文庫覆蓋率,而單個亞文庫可以針對細胞數量較少的全基因組進行篩選,如原代細胞、體內掃描等。這種亞文庫可以針對細胞數目的多少,更靈活的對細胞的全基因組進行篩選。
  3. 不同的載體系統病毒滴度比較

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參考文獻

  1. Sanjana, N.E., O. Shalem and F. Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 783-4.